【JEV】病毒灭活方法对SARS-CoV-2感染人肺上皮细胞胞外囊泡特征的比较。

【Autoimmun Rev】外泌体作为自身免疫性疾病的生物标志物和药物载体：机遇与挑战。

【Mol Cancer】细胞外囊泡 microRNA 促进 T 细胞急性淋巴细胞白血病中的 Notch 信号通路激活。

【Mol Cancer】循环外泌体衍生的mRNA、miRNA和lncRNA的液体活检特征预测晚期胃癌患者新辅助化疗的疗效。

【Adv Mater】靶向m(6) Reader YTHDF1的工程化小细胞外囊泡通过表观遗传和免疫调节治疗胃癌。

【JEV】抑制ORAI1钙离子通道可以降低肿瘤细胞分泌的PD-L1外泌体，有助于减缓肿瘤生长。

【J Control Release】负载白藜芦醇的巨噬细胞外泌体通过靶向小胶质细胞缓解多发性硬化症。

【J Control Release】树突状细胞衍生的外泌体装载肿瘤新抗原用于个体化精准化肿瘤免疫治疗。

【Cancer Immunol Res】载有抗原的细胞外囊泡在检查点难治性黑色素瘤模型中诱导抗 PD-1 和抗 PD-L1 治疗的反应。

【ACS Nano】诱导性多能干细胞衍生的小细胞外囊泡使衰老的血脑屏障恢复活力，以防止老年小鼠发生缺血性中风。

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作为新兴研究领域，外泌体研究的技术方法从最初的不完善，正在走向标准化。

国际细胞外囊泡学会（ISEV）分别在2014年和2018年发表了EVs的研究方法和质控标准。

但EVs的分离和纯化是EVs相关基础研究和临床应用的瓶颈问题之一，国内外学者也在尝试不同分离与富集方法。

不同研究目的对EVs的纯度要求不同，也就面临不同方法的选择，下面就几种常用的EVs分离与富集方法进行详细介绍。

超滤法（Ultrafiltration，UF）是一种相对快速和直接的技术。超滤特别适用于浓缩已通过其它方法分离的EVs，也可以用作主要的EVs分离/浓缩技术。

超滤法使用的膜通常由纤维素、聚砜等材质制成，截留分子量为10-1000 kD。而超滤的一种高级形式就是切向流过滤（TFF），区别于传统的死端过滤。

TFF是指液体流动方向与过滤方向垂直的过滤形式，切向流不断清洗冲刷膜表面，防止堆积，保持膜表面的清洁和持续工作。

基于TFF的过滤原理和EVs的颗粒分布，切向流超滤（TFU）是目前快速分离EVs的主要方法之一。

但TFU过程中膜容易堵塞，从而造成EVs的损失，该方法更适合从大体积样本中富集EVs。

图2 a）死端过滤；b）切向流过滤

尺寸排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一种根据粒径大小分离溶液中颗粒的方法，SEC柱采用树脂填充的多孔球形珠。

当含有外泌体的溶液加入到SEC柱中时，较小的颗粒将会被捕获在孔中，而较大的分子则不会进入孔中先被洗脱。因此首先洗脱下来的是大分子，小分子或颗粒会滞留在孔中，需要长时间才能洗脱下来。

SEC已经用于多种生物样本中EVs的分离制备，可单独使用或与其它分离方法搭配使用。

研究表明，用SEC进行EVs分离，并与基于聚乙二醇（PEG）的EVs富集方法相结合，具有很好的重复性。目前市场上基于该原理的纯化管柱参差不齐，也给广大客户带来不同的选择和不同的实验结果。

图3 尺寸排阻色谱法原理示意图

沉淀技术在半个世纪前就应用于富集和提纯病毒颗粒，而EVs和病毒颗粒有相近的生物理化特性，根据溶解度将EVs与其它化合物分离。最常用的亲水多聚物沉淀法是PEG沉淀法，PEG亲水性强，有较广范围的分子量，优良的适应性和富集功能使其成为目前商品化EVs富集试剂开发的热点。

图4 聚合物沉淀法

EVs的膜表面存在大量的标志物，利用免疫学中的抗原抗体作用及受体和配体之间的特异性反应，可将EVs有效地分离。目前基于免疫亲和性原理的EVs富集方法主要有免疫磁珠法和微流控技术。其中免疫磁珠法主要利用EVs膜上常见标志物（例如CD9、CD63、CD81等）以及其它肿瘤相关标志物等来特异性捕获与富集。微流控技术已经实现了对EVs的选择性分离纯化，基于EVs的物理和生物化学性质的微尺度分离。与其他方法相比，基于免疫亲和原理捕获的EVs纯度更高，利于自动化应用。

荷兰学者通过收集近两年共计700篇论文中描述的所有892种不同EVs分离方法，包括单一和组合的分离方法，分别对不同来源样本进行统计分析。

文章结果显示：约60%为组合的方法分离EVs，其中细胞上清和血清或血浆都存在6种以上的EVs组合分离方法。另外组合的方法在EVs产量和纯度方面整体上优于单一方法。

该文分析，无论起始的样本的类型如何，组合方法分离EVs都显示了明显的优势。但不同研究目的也会催生研究人员选择不同的分离方法，已有报道称SEC与一种离心的方法相结合可以有效地从血清或血浆的样本中去除脂蛋白等杂质。

且该文作者建议将SEC包括在EVs分离方法中，可提高EVs的纯度，同时会提高产量。

图6 不同分离方法获得EVs的产量和纯度统计

备注：CCS：细胞培养上清液，LSC：低速离心法，PK：蛋白酶K处理，TEI：总外泌体提取试剂盒，PEX：外泌体纯化试剂盒， EQ：Exoquick沉淀法，IBMF：免疫微流控技术，EP：Exoprep沉淀法，EXE：exoEASY外泌体提取试剂盒。

每一年都有很多EVs相关的研究报道，包括基础功能研究、临床诊断或疾病治疗等，但没有对EVs分离方法进行评估，不同分离方法可能会导致实验结果不可重复或EVs质量差等。总之，没有单一的EVs分离方法适合所有EVs的研究目的，组合的EVs分离方法逐渐成为一种趋势